Лекарственные препараты на основе олигонуклеотидов. Симпозиум «Инновационные лекарственные средства на основе пептидов и белков Лекарственные препараты на основе протеинов и олигонуклеотидов
04.07.2013 - 31.12.2013
Проведен систематический анализ современной литературы по теме исследования. Установлены последовательности наиболее перспективных, с точки зрения исполнителей проекта, производных олигонуклеотидов и их аналогов, которые должны проявлять противовирусную и антибактериальную активности.
Разработаны методики синтеза модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов или в режиме неавтоматизированного синтеза на твердотельном носителе. Для дизайна олигонуклеотидных производных с заданной функциональностью предложены различные подходы, в том числе, основанные на прогностическом анализе структуры и стабильности формируемых дуплексов с помощью метода молекулярной динамики. Предложен способ синтеза новых, ранее не описанных производных олигонуклеотидов, несущих модификации по атому фосфора межнуклеотидной фосфодиэфирной группировки.
Разработана методика анализа эффективности проникновения флуоресцеин-меченных соединений в бактериальные клетки. Показано, что положительно заряженные производные пептида Flu-(LR)4G-амида эффективно проникают и накапливаются в Pseudomonas aeruginosa, а эффективность проникновения в нее олигонуклеотидов без транспортного пептида низка.
Все разработанные при выполнении исследований методики, как синтетические, так и аналитические, внедрены в работу Лаборатории Биомедицинской Химии ИХБФМ СО РАН. Полученные теоретические наработки использованы в образовательных курсах.
Созданная в лаборатории синтетическая база для получения, выделения и характеризации олигонуклеотидов является уникальной для РФ и близка к уровню лучших мировых научно-исследовательских лабораторий соответствующей специализации. Привлечение специалистов биологического профиля делает лабораторию уникальной по потенциалу ее научно-исследовательской реализации в направлении разработки РНК-направленных противовирусных и антибактериальных препаратов.
Развернуть
01.01.2014 - 31.12.2014
i) Оценка антибактериальной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оценка антивирусной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к вируса гриппа WSN33/A/H1N1.
iii) Выбор последовательностей олигонуклеотидных аналогов- лидеров, проявляющих антибактериальную или противовирусную активность на требуемом уровне;
iv) Разработка протоколов синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих группы, которые увеличивают эффективность их накопления в эукариотических или бактериальных клетках
iv) Оценка эффективности проникновения и накопления разработанных соединений в бактериальных и эукариотических клетках.
v) Подготовленная лаборатория;
vi) Статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science.
vii) Тезисы докладов на конференциях;
viii) Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
ix) Конференция;
Развернуть
01.01.2015 - 31.12.2015
3.1 Антибактериальная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (в клеточной культуре);
3.2 Противовирусная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры, по отношению к вирусу гриппа in vitro;
3.3. Технологические и терапевтические характеристики отобранных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов с учетом путей коммерциализации препаратов, в том числе:
3.3.1 Список стандартизованных экспериментальных методик для оценки антибактериальной и противовирусной активности препаратов олигонуклеотидных аналогов in vitro (в культуре клеток) и in vivo (на животных моделях);
3.3.3 Отобранные олигонуклеотидные аналоги и конъюгаты, которые наряду с проявлением высокой антибактериальной и противовирусной активности способны к эффективному проникновению и накоплению в клетках, в том числе:
3.3.2.1 Данные по проникновению в клетки и доставки модифицированных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов;
3.3.2.2 Оптимизированный полупрепаративный синтез, пре- и пост-синтетические модификации, выделение и количественный контроль олигонуклеотидных аналогов, проявляющих антибактериальную и противовирусную активность;
3.3.2.3. Оценка разработанных соединений с антибактериальной и противовирусной активностью с точки зрения коммерческого использования.
3.4 Подготовленный финальный отчет по Проекту;
3.5 Подготовленная лаборатория;
3.6 Тезисы докладов на конференциях;
3.7 Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
3.8 3статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science
Председатели: Т.В. Овчинникова, Н.Ф. Мясоедов
Заседание 1
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, Т.В. Овчинникова
Большой зал
19 сентября, 9:30 - 11:30
25 мин Н.Ф. Мясоедов
Лекарственные средства на основе пептидов
20 мин С.А. Лимборская Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия
Молекулярно-генетические механизмы пептидной регуляции
15 мин Р.У. Островская
Ноопепт - новые механизмы действия и перспективы применения
15 мин Т.Н. Соллертинская 1 , М.В. Шорохов 1 , Н.Ф. Мясоедов 2 , Л.А. Андреева 2 1 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург; 2 Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия
Особенности нейропептидной коррекции когнитивных и психо-эмоциональных нарушений при синдроме хронической усталости у млекопитающих (эволюционные аспекты исследования)
15 мин И.И. Бобынцев , О.И. Сороколетова, А.Е. Белых Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Исследование анксиолитических и анальгетических эффектов пептида Gly-His-Lys (GHK) и его структурных аналогов
Заседание 2
Председатели: С.Н. Кочетков, Т.В. Овчинникова
Большой зал
19 сентября, 16:00 - 18:00
25 мин С.Н. Кочетков
Новые ингибиторы развития социально-значимых инфекций
20 мин Т.В. Овчинникова Институт биоорганической химии им. М.М.
Терапевтический потенциал антимикробных пептидов
15 мин В.Н. Кокряков 1,2 , О.В. Шамова 1,2 , Г.М. Алешина 1 , М.Н. Берлов 1,2 , Т.В. Овчинникова 3 1 Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург; 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург; 3 Институт биоорганической химии им.
Достижения отечественной школы биохимиков в изучении структуры и функций антибиотических пептидов животного происхождения
15 мин О.В. Шамова 1 , 2 , М.С. Жаркова 1 , П.М. Копейкин 1 , Т.А. Лукьянова 1 , А.Ю. Артамонов 1 , С.В. Баландин 3 , Т.А. Филатенкова 1 , А.С. Назаров 1,2 , К.Э. Сафиуллина 1 , М.С. Сухарева 1 , Т.Ю. Пазина 1 , Т.М. Гринчук 4 , В.Н. Кокряков 1,2 , Т.В. Овчинникова 3 , Д.С. Орлов 1,2 1 Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург; 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург; 3 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 4 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
Пролин-богатые пептиды врожденного иммунитета как прототипы новых антимикробных и противоопухолевых лекарственных препаратов
15 мин И.Е. Елисеев 1 , И.Н. Тертеров 1 , О.В. Шамова 2 , М.В. Дубина 1 1 Санкт-Петербургский академический университет; 2 Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, Россия
Использование паттернов аминокислотных последовательностей для дизайна альфа-спиральных антимикробных пептидов
15 мин М.Н. Берлов 1,2 , Е.С. Умнякова 1 , А.В. Соколов 1 , Т.В. Овчинникова 3 , В.Н. Кокряков 1,2 1 Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург; 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург; 3 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Взаимодействие катионных антимикробных пептидов с белком C1q и их влияние на активацию комплемента
Заседание 3
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, Л.П. Овчинников
Большой зал
20 сентября, 9:30 - 11:30
25 мин Л.П. Овчинников 1 , Н.В. Бобкова 2 1 Институт белка РАН, Пущино; 2 Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
Разработка инновационного лекарственного средства против болезни Альцгеймера на основе белка YB-1
20 мин О.М. Вольпина 1 , Д.О. Короев 1 , Т.Д. Волкова 1 , А.В. Камынина 1 , М.П. Филатова 1 , С.М. Баласанянц 1 , Н.И. Медвинская 2 , П.В. Некрасов 2 , И.В. Нестерова 2 , А.Н. Самохин 2 , Н.В. Бобкова 2 1 М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 2 Институт биофизики клетки РАН, Пущино Московской области, Россия
Протективная активность пептидов в нейродегенеративных процессах альцгеймеровского типа
15 мин А.В. Таллерова НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, Москва, Россия
Дипептидный миметик мозгового нейротрофического фактора ГСБ-106 - перспективный антидепрессант нового поколения
15 мин К.Н. Колясникова , Т.А. Гудашева, С.Б. Середенин НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, Москва, Россия
Замещенный глипролин ГЗК-111 - новый дипептид с анксиолитической и нейропротекторной активностями
15 мин А.В. Аветисян 1 , Р.А. Зиновкин 1 , Р.А. Симонян 1 , П.В. Некрасов 2 , А.Н. Самохин 2 , Д.О. Короев 3 , О.М. Вольпина 3 , Н.В. Бобкова 2 1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва; 2 Институт биофизики клетки РАН, Пущино; 3 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Синтетические пептиды к внеклеточному домену RAGE восстанавливают митохондрии в мозге бульбэктомированных мышей
15 мин А.Д. Слободина 1,2 , О.И. Большакова 1 , А.Л. Шварцман 1 , С.В. Саранцева 1 1 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, Гатчина; 2 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
Комбинированные пептиды как перспективные соединения для терапии болезни Альцгеймера
Заседание 4
Председатель: Е.Д. Свердлов
Большой зал
20 сентября, 16:50 - 18:50
15 мин В.А. Митькевич , А.А. Макаров Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
Разработка противоопухолевого средства на основе рибонуклеазы биназы
15 мин А.В. Степанов 1,2 , А.А. Белогуров 1,2 , А.Г. Габибов 1,2 1 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Применение химерных антигенных рецепторов Т-клеток слитных с лигандом В‑клеточного рецептора для терапии неходжкинских лимфом
15 мин В.А. Рихтер 1 , Е.В. Кулигина 1 , О.В. Коваль 1 , Г.В. Кочнева 2 , А.А. Немудрая 1 , А.А. Макарцова 1 , О.С. Троицкая 1 1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия 2 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии, Кольцово, Новосибирская обл., Россия
Способы повышения противоопухолевой эффективности Лактаптина
15 мин А.А. Розенкранц, Т.А. Сластникова, А.В. Уласов, А.С. Соболев Институт биологии гена РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Направленная внутриклеточная доставка противораковых агентов с помощью модульных нанотранспортеров
15 мин И.В. Алексеенко Институт молекулярной генетики РАН; Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Проблемы и перспективы генно-терапевтических препаратов для лечения рака
15 мин Д.В. Сверчинский , В.Ф. Лазарев, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
Модуляторы активности шаперона Hsp70 и их противоопухолевый потенциал
15 мин С.С. Ларин , М.И. Лукашина, А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, Е.Ю. Лысюк, Г.П. Георгиев Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
Мембраносвязанные и растворимые формы стресс-индуцированных MHC подобных молекул как перспективные маркёры в диагностике и терапии злокачественных опухолей
Заседание 5
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, В.А. Стоник
Большой зал
21 сентября, 9.30 - 11.30
25 мин В.А. Стоник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.В.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток, Россия
От исследований морских природных соединений к новым идеям и биопрепаратам
20 мин П.В. Сергиев 1,2 , И.А. Остерман 1,2 , Е.С. Комарова 1,2 , А.А. Богданов 1 , О.А. Донцова 1,2 1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 2 Сколковский институт науки и технологий, Москва, Россия
Поиск новых антибиотиков и изучение механизма их действия
15 мин Я.Р. Паникратова 1 , И.С. Лебедева 1 , О.Ю. Соколов 1 , Д.А. Куприянов 2 , А.Д. Румшиская 3 , Н.В. Кост 1 , Н.Ф.Мясоедов 1 1 ФГБНУ НЦПЗ; ‑ 2 ОО Филипс; 3 ФГАУ «ЛРЦ» МЗ РФ, Москва, Россия
Изучение влияния Семакса на активность нейрональных сетей головного мозга человека методом функциональной магнито-резонансной томографии (фМРТ)
15 мин Е.Ф. Колесанова , Е.А. Егорова, В.Н. Прозоровский, О.М. Ипатова НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
Синтетические пептиды в инновационных лекарственных препаратах: пептидные иммуногены и пептиды-транспортеры
15 мин Б.П. Челобанов 1,2 , А.А. Фокина 1 , А.М. Ильина 2 , К.В. Клабенкова 2 , Е.А. Буракова 1 , M. Фуджии 3 , Д.А. Стеценко 1,2 1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; 2 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия; 3 Университет Киндай, Фукуока, Япония
Пептидные конъюгаты аналогов олигонуклеотидов как потенциальные терапевтические агенты
15 мин А.А. Замятнин (мл.) 1,2 , А.В. Балакирева 1 , Н.В. Гороховец 1 , Е.Ю. Зерний 2 , Н.В. Кузнецова 1 , В.А. Макаров 1 , А.И. Петушкова 3 , Л.В. Савватеева 1 1 Институт молекулярной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва; НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва; 3 Биологический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Создание энзиматического средства для эффективной детоксификции глютена
Заседание 6
Председатели: В.М. Липкин, Т.В. Овчинникова
Большой зал
21 сентября, 16.15 - 18.15
15 мин И.А. Гривенников 1 , Е.В. Новосадова 1 , С.А. Антонов 1 , Е.С. Мануилова 1 , Е.Л. Арсеньева 1 , М.А. Грефенштейн 1 , А.М.Зыкова 1 , Кобылянский А.Г. 1 , В.В. Симонова 3 , Л.Г. Хаспеков 3 , О.С. Лебедева 2 , М.А. Лагарькова 2 , С.Н.Иллариошкин 3 , В.З. Тарантул 1 ,Н.Ф. Мясоедов 1 1 Институт молекулярной генетики РАН; 2 ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России; 3 Научный центр неврологии РАМН, Москва
Тест-система на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
15 мин Е.В. Новосадова , Е.Л. Арсеньева, Е.С. Мануилова, М.А. Грефенштейн, Н.Ф. Мясоедов, И.А. Гривенников Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия
Пептиды семейства меланокортинов способны модулировать экспрессию нейронспецифичных генов в процессе нейрональной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
15 мин А.П. Богачук 1 , З.И. Сторожева 2 , Ю.А. Золотарев 3 , Г.И. Ковалев 4 , В.Н. Азев 5 , А.Н. Мурашев 5 , Д.И. Ржевский 5 , Г.Б. Телегин 5 , В.М. Липкин 1 1 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; 2 Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского; 3 Институт молекулярной генетики РАН; 4 НИИ фармакологии РАН, Москва, Россия; 5 Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино Московской области, Россия
Доклинические исследования нового нейропротекторного лекарственного средства на основе пептида
15 мин Ю.А. Золотарев 1 , Г.И. Ковалёв 2 , Н.В. Кост 3 , О.Ю. Соколов 3 , А.К. Дадаян 1 , В.С. Козик 1 , С.И. Шрам 1 , Е.В. Васильева 2 , А.П. Богачук 4 , В.М. Липкин 4 , Н.Ф. Мясоедов 1 1 Институт молекулярной генетики РАН; 2 НИИ фармакологии им. В.В. Закусова; 3 Научный центр психического здоровья; 4 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Анксиолитическая и нейропротекторная активность регуляторного пептида HLDF-6 на моделях болезни Паркинсона и тревожных расстройств
15 мин А.К. Дадаян 1 , Ю.А. Золотарев 1 , В.С. Козик 1 , С.И. Шрам 1 , И.Ю. Нагаев 1 , В.Н. Азев 2 , А.П. Богачук 3 , В.М. Липкин 3 , Н.Ф. Мясоедов 1 1 Институт молекулярной генетики РАН, Москва; 2 Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино; 3 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Фармакокинетика ацетамидной формы пептида HLDF-6 в тканях лабораторных животных с использованием меченных тритием и дейтерием производных.
Нуклеотимды -- фосфорные эфиры нуклеозидов, нуклеозидфосфаты. Свободные нуклеотиды, в частности АТФ, цАМФ, АДФ, играют важную роль в энергетических и информационных внутриклеточных процессах, а также являются составляющими частями нуклеиновых кислот и многих коферментов.
Соединения, состоящие из двух нуклеотидовых молекул, называются динуклеотидами , из трёх -- тринуклеотидами , из небольшого числа -- олигонуклеотидами , а из многих -- полинуклеотидами , или нуклеиновыми кислотами .
Морфолино (англ. Morpholino ) -- синтетические олигонуклеотиды, применяемые в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Антисмысловые олигомерные морфолино используются для блокировки доступа других молекул к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют небольшие одноцепочечные участки (около 25 нуклеотидов) на поверхности молекул РНК .
Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой длинные последовательности нуклеотидов ДНК в хромосомах. Если какой-то ген должен экспрессироваться, то запускается процесс транскрипции этого гена, в результате которого синтезируется мРНК.
Терапевтический эффект синтетических антисмысловых олигонуклеотидов зависит от спецефичности их гибридизации с доступным сайтом м РНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличию системы доставки в клетку .
На сегодняшний день наиболее эффективное адресное направленное выключение активности определённых участков генома осуществляется антисмысловыми олигонуклеотидами (АОН). Стратегия использования АОН основана на уотсон-криковском взаимодействии молекул ДНК с М-РНК-мишеныо. Образование гетеродуплекса ДНК-МРНК приводит к инактивации М-РНК и последующей остановке синтеза белка.
Иными словами, под антисмысловым механизмом подразумевается связывание олигонуклеотида с комплементарным участком целевой РНК и подавление внутриклеточной функции данной РНК.
Однако, эта простая и привлекательная теоретическая модель в действительности оказалась значительно сложнее. Известны три типа антисмысловых молекул: относительно короткие синтетические олигонуклеотиды; антисмысловые РНК, экспрессирующиеся в клетке после трансфекции антисмысловым геном рибозимы, обладающие каталитической активностью .
Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок. Эта технология дает исследователю возможность направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью. Если какой-то белок способствует росту раковой клетки, то, используя соответствующий антисмысловой олигонуклеотид, можно сделать так, что этот белок больше никогда не будет синтезироваться в клетке. Антисмысловые олигонуклеотиды настолько специфичны, что воздействие на какой-либо другой белок в клетке практически исключено. Такая специфичность обеспечит ослабление побочных эффектов, зачастую наблюдаемых при традиционных способах лечения рака.
Механизм инактивации до сих пор до конца не ясен. Но, возможно, это связано с тем, что двунитевая РНК нехарактерна для нормальных клеток. Так как сигналом для синтеза каждого белка является одна единственная мРНК, то такой сигнал для определенного белка можно выключить или «нокаутировать» с помощью такой комплементарной последовательности .
Рис.4 Механизм работы антисмыслового олигонуклеотида
Важной проблемой лечения препаратами на основе антисмысловых олигонуклеотидов является разрушение таких лекарственных средств ферментами клеток - нуклеазами. Олигодезоксонуклеотиды разрушаются нуклеазами, поэтому очень важно защитить их от действия последних так, что бы они не утратили способности гибридизации с мишенью. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или З"-конпам мРНК, границам экзонов и интро- нов и даже двухцепочечным областям. Олиго- дезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания и де- зоксирибозу .
Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфо- группу, в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК--ДНК-дуплексы, которые активируют ри- бонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов -- лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний .
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями. Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле- родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Олигонуклеотид – это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты менее 50 нуклеотидов в длину. В течение последних 20 лет, смысл расширился, чтобы включать в себя все химически синтезированные нуклеиновые кислоты, независимо от длины. Первая публикация о направленном химическом синтезе олигонуклеотида появилась в 1955 году.
С тех пор, миллионы олигонуклеотидов синтезируются каждый год для использования в лабораториях по всему миру. Для большинства исследований нужны лишь небольшие количества ДНК. Гораздо большее количество ДНК (10 мкмоль или более) необходимы для использования в биофизических исследованиях (ЯМР и рентгеновской кристаллографии) поэтому, чтобы обеспечить синтез столь больших количеств, были разработаны методы твердофазного синтеза, что позволяет использовать олигонуклеотиды в качестве молекул лекарственного средства (например, антисмысловые олигонуклеотиды).
Синтез ДНК или РНК олигонуклеотидов относится к химическому синтезу фрагментов нуклеиновых кислот с определенными химическими структурами или последовательностей в различных размерах.
Рис.1. Структуры олигонуклеотидов.
Принцип твердофазного синтеза впервые был разработан и применен для синтеза полипептидов Роберта Брюса Меррифилда, американского биохимика, который получил Нобелевскую премию по химии в 1984 году за изобретение твердой фазы синтеза пептидов. Он понял, что ключ к успешному синтезу заключается в закреплении первого мономера к нерастворимой полимерной твердой фазе. Другие мономеры затем могут быть соединены, один за другим, к неподвижному терминальному концу растущего полимера. В конце синтеза, завершенная полимерная цепь может быть отсоединена от нерастворимого полимера и очищена. Этот процесс был оптимизирован на протяжении многих лет, чтобы стать высокоэффективным и теперь стал принципиально важным методом, используемым в автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторах.
Для обеспечения успешного синтеза олигонуклеотидов необходимы следующие условия:
- Все реагенты должны быть растворимы в неводных растворителях.
- Амино- и гидроксильные группы нуклеотидных оснований и углеводных остатков должны быть соответствующим образом блокированы.
- Защитные группы, введенные в процессе синтеза, должны быть стабильными в условиях удлинения цепи при образовании межнуклеотидной фосфодиэфирной связи.
- Защитные группы должны быть достаточно лабильными, чтобы их можно было удалить в конце синтеза, не повредив продуктов реакции.
Функции олигонуклеотидов и перспективы их применения
В настоящее время олигонуклеотиды и их аналоги широко используются в различных областях, таких как медицина и в молекулярно-биологических исследованиях, а также рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств и зондов для молекулярной диагностики.
За последние 20 лет относительно хорошо были изучены только два типа аналогов нуклеиновых кислот с формально электронейтральным остовом – пептидные нуклеиновые кислоты и фосфордиамидные морфолиноолигонуклеотиды. Аналоги обоих типов способны к комплементарному связыванию с природными молекулами ДНК и РНК, и в силу этого они нашли применение как в молекулярной биологии, так и, в особенности, в медицине в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Кроме того, с развитием ДНК-технологий появилась возможность изучения экспрессии известных генов, определения мутаций в геномах различных организмов и проведения диагностики ряда инфекционных заболеваний. В решении этих задач наиболее перспективным является использование ДНК-чипов, представляющих собой небольшие пластины с нанесенными на их поверхность фрагментами ДНК.
Способ создания ДНК-чипов объединяет методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа. Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5’-конце лабильную защитную группу, снятие которой возможно под действием светового излучения, электрического напряжения или в ходе кислотного гидролиза.
Показано, также, что ген-направленные олигонуклеотиды, в зависимости от выбранного гена-мишени, отличаются значительным разнообразием модулирующих эффектов на опухолевые ткани, начиная от замедления и остановки пролиферации опухолевых клеток и заканчивая подавлением их инвазивных свойств.
Противоопухолевые препараты на основе нуклеиновых кислот представляют собой высокоспецифичный инструмент модуляции экспрессии генов. Подавление ряда генов, аномально высокая экспрессия которых возникает при неопластической трансформации, можно осуществить с помощью препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (asON). В общем, механизм подавления экспрессии генов заключается в их комплементарном связывании с мРНК-мишенью, после чего целевая мРНК либо подвергается расщеплению, либо блокируется процесс ее трансляции.
asON представляют собой синтетические одноцепочные ДНК длиной 15-20 нуклеотидов. В последнее время были получены asON, способные препятствовать транспорту сплайсированной мРНК из ядра в цитоплазму, а также asON, которые в результате блокирования сайта сплайсинга в пре-мРНК способны приводить к экспрессии альтернативного варианта белка.
Ввиду того, что природные олигодезоксирибонуклеотиды в культуре клеток и в условиях in vivo подвергаются быстрой деградации под действием нуклеаз, для повышения их стабильности в структуру asON вводят различные химические модификации.
Химический синтез олигонуклеотидов
Твердофазный синтез широко используется в синтезе пептидов, синтезе олигонуклеотидов, синтезе олигосахаридов и комбинаторной химии. Твердофазный химический синтез был изобретен в 1960-е годы Брюсом Меррифилдом, и был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году.
Твердофазный синтез осуществляют на твердом носителе, между фильтрами, в столбцах, которые пропускают все реагенты и растворители. Твердофазный синтез имеет ряд преимуществ по сравнению с синтезом в растворе:
обеспечивает высокую скорость реакции
примеси и избыток реагентов смываются, поэтому очистка после каждого шага не требуется
процесс поддается автоматизации на твердофазных синтезаторах с компьютерным управлением.
Твердые носители (называемые также смолами) представляют из себя нерастворимые в воде частицы, как правило, 50-200 мкм в диаметре, к которым олигонуклеотид присоединяется в процессе синтеза.
Имеются данные, что одним из наиболее эффективных материалов, которые можно использовать в качестве твердого носителя, является пористое стекло. Оно достаточно жесткое и не способно к набуханю. В его глубоких порах, происходит синтез олигонуклеотидов. Стекло содержит 500 Å (50 нм) поры, которые подходят для синтеза коротких олигонуклеотидов. Тем не менее, оно плохо подходит для синтеза олигонуклеотидов более 40 оснований в длину. Это связано с тем, что растущий олигонуклеотид блокирует поры и уменьшает диффузию реагентов через матрицу.
Твердые носители для обычного синтеза олигонуклеотидов, как правило, изготовлены с нагрузкой 20-30 мкмоль нуклеозида на грамм смолы. Синтез олигонуклеотидов при более высоких нагрузках становится менее эффективным вследствие стерических затруднений между соседними цепями ДНК, присоединенных к смоле.
Этапы химического синтеза олигонуклеотидов
Фосфорамидатный олиго-синтез протекает в 3′- к 5′-направлении (противоположном 5′- к 3′-направлении биосинтеза ДНК в репликации ДНК). Один нуклеотид добавляется за синтез цикла.
Рис. 2. Фосфорамидатный олигонуклеотидный цикл синтеза
В начале олигонуклеотидного синтеза первый нуклеозид предварительно присоединяют к смоле (носителю), и выбираются колонны синтеза A, G, C или T в зависимости от нуклеозида на 3′-конце желаемого олигонуклеотида. Закрепленный нуклеозид имеет 5′-ДMT защитную группу (ДМТ = 4,4′-диметокситритил), роль которой состоит в предотвращении полимеризации, и эта защитная группа должна быть удалена (детритилирование). Механизм детрилирования показан на рисунке 3.
Рис.3. Механизм удаления защитной группы.
После детритилирования, закрепленный нуклеозид готов реагировать со следующим основанием, который добавляется в виде нуклеозид-фосфорамидатного мономера. Большой избыток соответствующего нуклеозида, смешивают с активатором (тетразолом или его производными). Диизопропиламиногруппа нуклеозида протонируется активатором, и, таким образом, превращается в хорошо отсоединяющуюся группу. Она быстро вытесняется 5′-гидроксильной группой связанного нуклеозида, создавая фосфит триэфир (рис. 4).
Рис.4. Механизм протонирования активатором.
Нуклеозидные фосфорамидиты достаточно стабильны в инертной атмосфере, и могут быть получены в больших количествах, доставляться по всему миру, и храниться в виде сухого твердого вещества в течение нескольких месяцев перед использованием.
Однако даже при высокоточных работах по синтезу олигонуклеотидов, остается вероятность, что там будет несколько непрореагировавших 5′-гидроксильных групп, которые будут доступны для участия в следующей стадии. Если подобное нарушение не остановить, они будут накапливаться с каждым последующим циклом, и конечный продукт будет сложной смесью олигонуклеотидов, большинство из которых будет нести неправильную генетическую информацию.
Поэтому метод ацетилирования 5′-гидроксильных групп делает их инертным по отношению к последующей реакции. Это необходимо также и для минимизации примесей.
Фосфит-триэфир (Р (III)), образованный на стадии присоединения неустойчив к кислотам и должен быть преобразован в стабильную форму (P (V)). Это достигается за счет окисления йода в присутствии воды и пиридина (рис. 5). Полученный фосфотриэфир фактически представляет собой ДНК ось, защищенную 2-цианоэтил группой. Группа цианоэтила предотвращает нежелательные реакции с фосфором во время последующих циклов синтеза.
Рис.5. Механизм окислительной стадии.
После этого, ДМТ-защитная группа на 5′-конце цепи ДНК должна быть удалена так, чтобы первичная гидроксильная группа могла вступить в реакцию со следующим нуклеотид-фосфорамидатом. Реакция удаления защитной группы с помощью трихлоруксусной кислоты в дихлорметане протекает быстро. Цикл повторяется, один раз для каждой основы, до получения требуемого олигонуклеотида.
Далее необходимо отсоединить синтезированный олигонуклеотид от твердого носителя. В этом случае используется сукцинил. Разделение возможно при обработке концентрированным водным раствором аммиака при комнатной температуре в течение одного часа (рис. 6).
Рис.6. Механизм отделения олигонуклеотида от твердого носителя в концентрированном водном растворе аммиака.
Реакция расщепления осуществляется автоматически на некоторых синтезаторах, и аммиачный раствор, содержащий олигонуклеотид, поступает в стеклянный флакон. В качестве альтернативы, расщепление может быть осуществлено вручную путем принятия колонки от синтезатора и промыванием в шприцах, содержащих гидроксид аммония.
Олигонуклеотид растворяется в концентрированном водном растворе аммиака, а последующий нагрев позволяет удалить защитные группы из гетероциклических оснований и фосфатов. Водный раствор затем удаляют выпариванием и олигонуклеотид готов к очистке.
Кроме ДМТ-защитной группы, необходимы также дополнительные защитные группы и для аденина, цитозина и гуанина (рис.7). Однако для тимина в этом нет необходимости.
Рис.7. Структуры защитных групп, обычно используемые для защиты адениновых, цитозиновых и гуаниновых оснований во время фосфорамидатного синтеза ДНК олигонуклеотидов.
Выводы
1. Искусственно синтезированные олигонуклеотиды находят все более широкое применение в различных областях науки, а методы их получения все более совершенствуются, что позволяет синтезировать достаточное количество олигонуклеотидов для лабораторных экспериментов и для создания терапевтических препаратов.
2. На сегодняшний день, самым распространенным методом синтеза олигонуклеотидов остается метод твердофазного синтеза, который позволяет существенно ускорять процесс получения олигонуклеотидов, а также уменьшать объемы затраченных реактивов.
Лекарство для генов
Давняя мечта медиков - иметь в своем распоряжении вещества, которые действовали бы на конкретные гены, т.е. на первопричину многих болезней. Ведь на основе таких веществ можно создавать лекарственные препараты - настоящие «волшебные пули», способные поражать наследственный материал различных инфекционных агентов, не принося вреда организму человека, а также подавлять активность онкогенов, ответственных за злокачественный рост клеток. Создание подобных веществ, направленно воздействующих на генетический материал, - одна из главных задач молекулярной биологии, поскольку с их помощью можно исследовать функции генов и, в конечном счете, управлять работой последних
Но каким образом можно изменить нужную генетическую программу? Ведь все гены имеют сходные химический состав и структуру: различия между ними сводятся лишь к порядку чередования четырех мономерных блоков - нуклеотидов A, T, G, C. Для того чтобы воздействовать на определенный ген, молекула вещества должна каким-то образом распознать эту нуклеотидную последовательность - задача, на первый взгляд, неразрешимая.
Но группа сибирских химиков, приехавших в Новосибирский академгородок в первые годы его создания, считала иначе. Сотрудники Института органической химии СО АН СССР (Новосибирск) Н. И. Гринева и Д. Г. Кнорре на основе принципа молекулярного узнавания, используемого самой природой, сформулировали идею направленного воздействия на гены с помощью олигонуклеотидов - фрагментов нуклеиновых кислот, «вооруженных» специальными химическими группами. Первую работу по олигонуклеотидам сибирские химики опубликовали в 1967 г. - именно эта дата и считается сегодня официальной датой возникновения нового направления в молекулярной биологии и фармакологии.
Они были первыми
Осуществление этого необычного по смелости проекта (в то время нигде в мире даже не планировалось проведение подобных исследований) на начальной стадии велось небольшой группой молодых сотрудников, аспирантов и студентов НГУ. Начинать пришлось практически с нуля, поскольку тогда еще не умели синтезировать олигонуклеотиды в заметных количествах; не существовало технических приборов, необходимых для работы с малыми количествами нуклеиновых кислот и эффективной методики определения их последовательности. Решить эти проблемы нашим химикам удалось благодаря междисциплинарности - одному из принципов, легших в основу деятельности Сибирского отделения.
В НИОХ было организовано производство нуклеиновых кислот, разработаны методы их химической модификации; совместно с сотрудниками Института ядерной физики удалось создать приборы для анализа нуклеиновых кислот и манипуляции с их малыми количествами, а совместно с химиками МГУ - развернуть работы по созданию автоматических синтезаторов олигонуклеотидов. В результате в распоряжении ученых оказались практически все необходимые аналитические методы и приборы - биологические исследования можно было начинать.
Эксперименты, проведенные сначала на простых моделях, а затем на природных нуклеиновых кислотах, показали, что олигонуклеотиды действительно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами - мишенями с высокой степенью избирательности. В том случае, когда к олигонуклеотидам присоединены реакционно-способные группы, происходит направленная химическая модификация мишеней - нуклеиновых кислот. К тому же, впервые было продемонстрировано, что с помощью этих реагентов можно подавить вирусные инфекции у животных, а также доказана возможность введения их в организм через кожу и слизистые оболочки и т. п.
Ранние публикации, посвященные биологическим эффектам, производимым олигонуклеотидами, вызвали огромный интерес специалистов во всем мире. В 1988 г. в Академгородке был проведен первый в мире симпозиум по ген-направленным веществам на основе фрагментов нуклеиновых кислот. В работу по созданию подобных препаратов включились ученые США, Франции, а затем и других стран; возникли десятки компаний, поставивших перед собой цель создать терапевтические препараты на основе олигонуклеотидов.
Комплементарное лекарство
Первыми из препаратов ген-направленного действия стали так называемые антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для избирательной инактивации вирусных РНК и некоторых клеточных РНК. Изначально предполагалось, что к этим олигонуклеотидам будут присоединены реакционно-способные группы, которые должны химически модифицировать или разрушать целевые нуклеиновые кислоты. Однако выяснилось, что присоединение олигонуклеотидов к РНК-мишени само по себе оказывает на нее настолько большое влияние, что может провоцировать ее разрушение клеточными ферментами.
Д. Г. КНОРРЕ - академик РАН, специалист в области химической кинетики, молекулярной биологии и биоорганической химии. Заведующий лабораторией химии природных полимеров (1960-1984 гг.), отделом биохимии и лабораторией химии нуклеиновых кислот (1970-1984 гг.) Института органической химии СО АН СССР, директор Института биоорганической химии СО АН СССР и СО РАН (1984-1996 гг.)
Антисмысловые подходы, основанные на использовании нуклеотидов и нуклеиновых кислот для подавления биологической активности нуклеиновых кислот, сулят интересные перспективы в тех случаях, когда нужно задавить реализацию нежелательной информации в живых организмах. В первую очередь открывается перспектива создания нового поколения противовирусных и противоопухолевых препаратов. Такие препараты имеют одно неоспоримое преимущество перед другими… Все олигонуклеотиды независимо от мишени, на которую они нацелены, могут быть созданы по единой технологии. Варьировать нужно только последовательность нуклеотидов. В частности, в вирусологии и онкологии часто приходится сталкиваться с таким явлением, как возникновение устойчивости к препаратам. Это происходит чаще всего потому, что у отдельной вирусной частицы или отдельной раковой клетки происходит мутация, приводящая к такой устойчивости. В любом другом случае нужно начинать эмпирический поиск нового лекарственного препарата. В случае антисмысловых воздействий нужно только определить, какое изменение в структуре вирусного генома или онкогена привело к появлению устойчивости. После чего сразу становится ясным, как по той же единой технологии создавать новый препарат *.
* Соросовский образовательный журнал. - 1998. - 12. - C. 25-31.
Самым мощным средством «выключения» генов оказались интерферирующие РНК - короткие двуцепочечные комплексы из РНК-олигонуклеотидов. Когда такой комплекс вводят в клетку, одна из цепочек связывается с комплементарной ей последовательностью в информационной РНК клетки. Это служит сигналом к началу работы группы ферментов, которые разрезают РНК, связанную с олигонуклеотидами. В результате программа синтеза определенного белка исчезает.
В 2006 г. за объяснение действия механизма РНК-интерференции два американских исследователя были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Создание регуляторов экспрессии генов на основе интерферирующих РНК открыло большие возможности для получения широкого спектра высокоэффективных нетоксичных препаратов, подавляющих экспрессию практически всех, в том числе опухолевых и вирусных, генов.
Правильные мутации
Внимание специалистов давно привлекают и методы мутагенного воздействия на ДНК с помощью олигонуклеотидов или их производных. В случае успеха может стать реальным то, что сегодня кажется фантастикой: коррекция дефектных генетических программ.
Экспериментально уже доказано, что с помощью коротких олигонуклеотидов можно вносить в генетические программы точечные мутации. Как это осуществить? Мутагенные олигонуклеотиды, содержащие «неправильные» нуклеотидные блоки, вводятся в клетку, где они соединяются с ДНК. В результате в некоторых участках нуклеотидных последовательностей появляются «неправильные», т. е. некомплементарные, пары оснований, что и воспринимается клеточной системой репарации («ремонта») ДНК как повреждение. Нуклеотиды в подобной паре заменяются репаративными ферментами таким образом, чтобы она стала «правильной», комплементарной. При этом замена может происходить как в олигонуклеотидной последовательности, так и в самой клеточной ДНК.
В последнем случае мы имеем дело с изменением генетической программы, т. е. с мутацией. И хотя эффективность подобного мутационного процесса в целом невелика, он может быть использован применительно к новым клеточным технологиям. Например, стволовые клетки больного с каким-либо наследственным нарушением можно обработать избирательным мутагеном, а затем отобрать те из них, в которых произошла нужная мутация (т. е. клетки с «исправленной» генетической программой), размножить и ввести в организм.
1967 г. Опубликована первая работа по олигонуклеотидам - ген-направленным биологически активным веществамТаким образом, существующие на сегодняшний день олигонуклеотиды способны регулировать «работу» генов на различных уровнях. Так, вышеупомянутые антисмысловые олигонуклеотиды и интерферирующие РНК работают на стадии синтеза белка, воздействуя на матричные РНК - информационные молекулы, в которых происходит сборка полипептидных цепочек. Антигенные олигонуклеотиды, образующие комплексы с ДНК, подавляют экспрессию генов - образование самих матричных РНК, а олигонуклеотиды-аптамеры могут, подобно антителам, образовывать связи с определенными белками, блокируя их. Кроме того, некоторые олигонуклеотиды способны стимулировать работу иммунной системы - сегодня их используют в качестве компонентов вакцин.
В настоящее время разработку и синтез олигонуклеотидов и их аналогов ведут большие исследовательский и индустриальный секторы. Так, в прошлом году только объем рынка олигонуклеотидов, предназначенных для исследовательских целей, превысил 800 млн долларов! Сейчас разработаны и синтезированы десятки новых видов химически модифицированных олигонуклеотидов, идут испытания ряда противовирусных и противовоспалительных препаратов, полученных на их основе. Исследования подобного рода в России сейчас проводятся в основном в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, где работают ученики и последователи академика Д. Г. Кнорре.
Вот так плодотворность идеи, возникшей в Сибирском отделении сорок лет назад, была доказана самой жизнью. Используя в качестве базовых структур для создания ген-направленных биологически активных веществ короткие фрагменты нуклеиновых кислот, можно быстро разработать и внедрить в производство специфические лекарственные препараты практически против любого вируса. Для этого необходимо лишь расшифровать нуклеотидную последовательность вирусных генов, что несложно сделать с помощью современных технологий. У этого универсального подхода большое будущее: результаты исследований последних лет, в частности по направленному мутагенезу, позволяют рассчитывать на появление в скором времени эффективных лекарств для борьбы с заболеваниями, до сих пор считающихся неизлечимыми.
Возможно, будет полезно почитать:
- Патриарх кирилл запретил актеру и священнику ивану охлобыстину служить в церкви Охлобыстин церковный сан ;
- Иван охлобыстин - биография, информация, личная жизнь Почему охлобыстин ушел из священников ;
- Ужин для ребенка 4 лет рецепты меню ;
- Принципы функционирования бюджетной системы РФ ;
- Особенности размещения населения на территории земли Население земли размещается равномерно средняя плотность населения ;
- Тонька-пулеметчица — cтрашная судьба страшного человека Фильм палач тонька пулеметчица реальная история ;
- Как поздравить начальницу с юбилеем? ;
- Российские студенты выиграли чемпионат мира по программированию Вот они, герои ;